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DNA提取纯化检测

发布时间:2019-11-12 15:07

  DNA提取纯化检测_电脑基础知识_IT/计算机_专业资料。DNA提取纯化检测

  实验一 真核细胞染色体DNA的 分离、纯化和检测 实验目的 ? 通过实验学习从血液中制备染色体DNA的 方法。 学习琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的纯度、 DNA的构型、含量以及分子量的大小。 掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。 ? ? 实验原理 ? ? ? ? 红细胞裂解液裂解红细胞 细胞裂解液裂解白细胞 用蛋白酶K水解蛋白质 有机溶剂酚、氯仿抽提 ? ? ? 在高盐条件下,用乙醇沉淀DNA 再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分 即可获得染色体DNA 实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子 筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定,后者 则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其 等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动,在 用电泳法测定DNA分子大小时,应当尽量减少电荷效 应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应, 使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异 所决定,提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压, 也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。 实验原理 ? ? ? ? ? ? 纯净的DNA A260/A280=1.8,制备的DNA样品应该为1.7~1.8 纯净的RNA A260/A280=2.0,制备的RNA样品应该大于2.0 如果制备的DNA样品A260/A2801.7,说明样品中含酶和蛋 白质过高,应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提,再用乙醇沉 淀DNA; A260/A2802,说明样品中RNA过高,可用RNase消化后,用 酚、氯仿、异戊醇抽提,再用乙醇沉淀DNA; 如果样品A260/A280为1.8~2.0,说明样品中盐的含量过高, 样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。 提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质 会使A260/A280比值下降。 实验材料 红细胞裂解液 KHCO3 1g NH4Cl 8.3g EDTA· Na2 37mg (10mM) (155mM) (0.1mM) 裂解缓冲液(lysis buffer) 10mM Tris-Cl (pH8.0) 0.1M EDTA (pH8.0) 0.5%(m/v) SDS ACD抗凝液 柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1ml ACD液 组织细胞 动物血液样品,将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀,0℃下 保存数天或-70℃下长期冻存,备用。 实验材料 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 酚:氯仿:异戊醇(25:4:1) 70%乙醇 TE buffer RNAse 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统 染色体DNA的制备方法 1. 将800ul抗凝储冻血液置室温溶解。 2. 往管中加2ml红细胞裂解液,轻摇数次,置冰上15分钟,期间间歇摇动 几次,看管底沉淀,悬浮沉淀。 3. 6000rpm,室温离心10分钟,弃上清。 4. 往管中加入4ml红细胞裂解液,轻摇几次后,冰上5分钟,期间摇几次, 看管底沉淀,摇动试管悬浮沉淀。 5. 6000rpm,4℃离心5分钟,弃上清。 6. 重复步骤4、5,1-2遍(视红细胞洗净程度而定),至沉淀白色。 7. 用1×PBS 4ml洗涤所得沉淀,混匀,冰上5分钟,期间摇动几次。 8. 6000rpm,4℃离心5~10分钟,弃上清。 9. 每管中加入500μ l白细胞裂解缓冲液,重悬细胞,加入20μ l proteinase K(20mg/ml),混匀后置55℃水浴1小时,至溶液清亮(澄清)。 染色体DNA的制备方法 10. 用酚-氯仿(350μ l+350μ l)、氯仿(450μ l)分别抽提一次,每次 抽提后10000rpm,4℃离心5分钟,取上清(不要吸入有机相)。 11. 上清中加入2倍冰预冷无水乙醇和0.1倍3M NaAc。冰上20分钟或-20℃ 过夜。 12. 12000rpm,4℃离心10分钟,弃上清。 13. 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀1-2次,12000rpm,4℃离心5分钟,弃上清。 14. 室温干燥沉淀5分钟。 15. 加入100μ l DDW(无菌水),37℃水浴至DNA溶解。 16. 取样品10μ l,用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定样品。 17. 相对完整的染色体DNA在电泳图中只出现一条分子量较大的条带,不 会出现条带弥散现象。 18. 取样品10μ l,稀释100倍,测A260和A280,计算DNA浓度。 琼脂糖凝胶电泳方 法 1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平,检查稳压 电源与正负极的线. 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端,防止浇板时出现 渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳,垂直架在电泳板负极的一端,使点样 梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。 3. 制备琼脂糖凝胶:按照被分离DNA分子的大小,决定凝胶中琼脂糖的百 分含量。称取琼脂糖,溶解在电泳缓冲液中,大电泳槽约160毫升,小电 泳槽约35毫升凝胶液,置微波炉或水浴锅中加热,至琼脂糖全部溶化。 4.待凝胶溶液冷至50℃左右时,在凝胶溶液中加入EB(终浓度0.5μ g/ml), 摇匀,轻轻倒入电泳板上,除去气泡。 琼脂糖凝胶电泳方 法 5.待凝胶冷却凝固后(约30分钟),在电泳槽内加入电泳缓冲液,大电泳槽 约需1200ml,小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板,放入电泳槽,然后 小心取出点样梳,保持点样孔的完好,去除空内气泡。 6.待测的DNA样品中,加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液 (6×loading Buffer)。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释,再加五分 之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10μl样品与2μl溴酚蓝指 示剂点样缓冲液,混匀后小心地进行点样,记录点样顺序和点样量。 7.打开电源,DNA的迁移速度与电压成正比,与琼脂糖含量有关。最高电压 不超过5V/cm(大电泳槽不超过200V,小电泳槽不超过150V)。 8.电泳时间看实验的具体要求而定,在电泳途中可用紫外灯直接观察,DNA 各条条带分开后,可以结束电泳。一般20分钟~2小时,取电泳凝胶块直接 用凝胶成像系统成像和分析。 DNA样品的纯化和定量检测方法 1.取DNA粗制样品,加入RNase至终浓度10?g/?l,37 ℃反应0.5 小时。 2.加入酚:氯仿:异戊醇(25:4:1)等体积抽提1~3次,12000 rpm,离心5分钟,取上清。 3.加入1/10倍体积3M NaAc(pH5.2),2倍体积无水乙醇混匀, 室温下30~60min。 4.15000 rpm,离心10分钟。 5.DNA沉淀用冰预冷70 %乙醇洗1次,开盖37 ℃干燥10min(使乙 醇挥发)。 6.加入30?l TE buffer,37 ℃水浴至沉淀溶解。 7.取10 ?l DNA 1 %琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统记录和分析 结果,估计样品DNA分子量。 8.取10 ?l DNA母液稀释至1000ul,在紫外分光光度计上测A260 和A280。计算样品DNA浓度,判断样品浓度和DNA纯度。 DNA制备注意事项 1. 如要11步中完整的DNA,在12步时,挑出DNA沉淀,用70% 乙醇洗涤1-2次。 2. 步骤2、4、7中要颠倒摇动试管悬浮沉淀,不可用枪头 (尤其是没剪去枪头尖端)吹打沉淀。 3. 步骤10中吸上清枪头使用前必须粗吸头(微量移液枪的 枪头剪去尖端,并用火烧一下,使之圆钝),避免机械 剪切力对DNA链的损伤。 4. 为了获得高分子量的DNA,操作中必须防止混匀、抽提及 沉淀时剧烈机械震荡造成的DNA的断裂。 5. 如含有RNA,可用100ng/ml的RNase在37℃水解半小时。对 于新血液,取ACD或EDTA抗凝,10ml全血中加3.3ml ACD 或1ml EDTA。 电泳注意事项 1. 琼脂糖的质量: 琼脂糖(agarose)是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂 是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸 根和羟基的多糖。它具有离子交换性质,这种性质将给电泳 带来电渗作用的不良影响,因而必须去除干净。所谓琼脂糖 的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖 是一种直链多糖,它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残 基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以 氢键交联,因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性, 不含有带电荷的基因,不引起DNA变性,又不吸附被分离的物 质,因此它是一种很好的凝胶剂。 电泳注意事项 2. DNA分子的迁移率: 影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的,除了 决定于DNA分子大小与构型外,还有琼脂糖的浓度、电压 大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其 分子量的大小,采用一下措施: (1) 每次测定时,要有已知分子量的DNA片段作为标准, 进行对照。电泳。 (2) 选择最合适的电泳条件。 (3) 提高分子筛效应,降低电荷效应。 电泳注意事项 3. EB染色:EB是核酸的显色剂,使用EB对DNA染色的3种方法: (1) 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB。 (2) 只在胶中加入EB,在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受EB污 染的可能。 (3) 在电泳结束后,取出凝胶,放在含有EB的电泳缓冲液或DDW中浸染10-30 分钟。 4.溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用:含有50%蔗糖,可增加上样DNA溶液的密度, 以确保DNA样品沉入点样孔内,起DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚 蓝的电泳迁移位置相当于300~400bp双链线.点样量太高易产生拖尾与弥散现象,样品迁移速度减慢。点样量太少,分 辨不清,影响结果。 6.EB为强诱变剂,剧毒,操作时要带一次性手套,并在专区间操作。用过的 手套要及时将手套顺手翻过来,让有EB的面朝里,有EB的废液和器皿不能 随便丢弃,要用专门方法处理后丢弃。 DNA定量检测注意事项 ? ? 测定光吸收值时,用稀释DNA样品的溶液 做对照。 选择稀释要适当,应在检测范围之内。 思 考 题 1. 实验中影响染色体DNA完整的因素有哪些?如何 减少这些因素对完整性的影响? 2. 3. 如何判断提取的染色体DNA样品的质量? 为了获得清晰的DNA样品电泳图,在琼脂糖凝 胶电泳过程中应该注意哪些问题? 4. 5. 如何选择测量DNA的合适的稀释倍数? 为什么需要对DNA进行纯化?

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